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在我们日常的科研中，细胞实验是每个课题必不可少的一部分。细胞实验具有重要的意义，可以通过细胞实验的数据评估药物的有效性、毒性、耐药性、药物对细胞凋亡、增殖等作用的影响。下面我们来一起学习细胞实验相关的知识把！
细胞的复苏
细胞复苏的概述
细胞复苏的原则——快速融化：须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
实验步骤
1、实验前准备
（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管
（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3、迅速解冻
（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的冻存细胞外的冰晶迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4、平衡离心
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min。
5、制备细胞悬液
（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6、细胞计数
细胞浓度以5×105/ml为宜。
7、培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
注意事项
1、选择合适的转染试剂及复合物配比浓度；
2、纯化 siRNA；
3、避免 RNA 酶污染；
4、健康的细胞培养物；
5、避免使用抗生素；
6、避免培养细胞用无血清的培养基。
细胞的传代
实验原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就须进行传代。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
实验材料
1、细胞：贴壁细胞株；
2、试剂：0.25%胰酶、1640培养基（含10%小牛血清）；
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等。
实验步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
注意事项
消化液配制方法：
称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA，使终浓度达0.02%。
细胞冻存
实验原理
在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
实验材料
生长良好的培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。
实验步骤
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形,细胞应该处于对数生长期。
2、配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3、依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度。
4、先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
5、接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
6、置于-80超低温冰箱中放置过夜。
7、置于液氮罐中长期保存。
8、同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
细胞培养中的无菌操作技术
注意事项
1、实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。
2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘的非无菌区域操作。
3、小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4、工作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心毒性药品，并避免尖锐针头的伤害等。
5、定期检测下列项目：
（1）CO2 钢瓶的CO2压力。
（2）CO2 培养箱的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
（3）无菌操作台内的airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6、水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
TUNEL染色检测细胞凋亡
实验概述
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在钙离子和镁离子依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
实验原理
过氧化物酶标记测定法。
原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞。
实验材料
试剂配制：
1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。
4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。
5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。
6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml。
7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。
8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）。
实验步骤
1、标本预处理：
（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。
（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。
3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。
5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。
6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。
9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，后1次5min。
10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。
11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
注意事项
要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松处理的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶。
MTT实验
实验原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
实验步骤
1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml） 20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项
1、选择适当得细胞接种浓度。
2、避免血清干扰。
3、设空白对照。
4、MTT实验吸光度要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
实验应用
1、检测细胞表面以及胞内的各种标志，对细胞进行分群鉴定以及比较各种蛋白表达量高低。
2、检测细胞的增殖以及凋亡。
3、流式细胞术可用来分析细胞周期。
